軟骨細胞培養(yǎng)指南
20世紀60年代起人們對軟骨組織的研究進入到細胞水平。
1967 年 ManningWK 等使用胰蛋白酶聯(lián)合細菌膠原酶消化分離與培養(yǎng)人軟骨細胞獲得成功。
目前人軟骨細胞體外分離與培養(yǎng)的方法已被廣泛應用于軟骨細胞生物學研究，為骸骨軟化癥、骨關節(jié)炎( osteoarthritis ， OA )等疾病的防治及組織工程技術修復軟骨缺損等研究提供了重要的方法學參考。
人軟骨細胞特點
幼稚的軟骨細胞位于軟骨組織的表層，單個分布，體積較小，呈橢圓形，長軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細胞體積之間增大呈圓形，細胞核圓形或卵圓形，染色淺，細胞質弱嗜堿性，常見數(shù)量不一的脂滴。
成熟的軟骨細胞多2~8個成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成，稱為同源細胞群。電鏡下，軟骨細胞有突起和皺褶，細胞質內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質網(wǎng)和發(fā)達的高爾基復合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。
軟骨細胞培養(yǎng)及傳代
圖A為原代細胞分離培養(yǎng)軟骨細胞貼壁后的形態(tài)，細胞呈多角型，扁平狀，胞質豐富，可見清晰、圓形的細胞核，部分區(qū)軟骨細胞集落樣生長。
圖B為軟骨細胞傳代培養(yǎng)后的形態(tài)，細胞似橢圓形，細胞胞漿豐富。
隨傳代次數(shù)不斷增加，軟骨細胞集落中的梭形細胞數(shù)目逐漸增多。
為什么一傳代就變形？
在體外培養(yǎng)人軟骨細胞時，隨著傳代次數(shù)增加軟骨標志性蛋白Ⅱ膠原合成分泌減少，而Ⅰ、Ⅲ型膠原合成分泌增多。
Ⅱ膠原的合成和分泌是維持軟骨細胞分化表型的特征性指標，提供了軟骨特有的張力和硬度。
軟骨中的其他分子與膠原蛋白結合形成網(wǎng)狀結構，支持軟骨具有一定的彈性，對于軟骨維持形狀及承載外來負荷起著非常重要的作用。
所以，隨著傳代次數(shù)的增加，維持細胞形態(tài)的物質會逐漸減少，細胞的形態(tài)就會發(fā)生改變。
這種形態(tài)和功能的變化稱之為反分化現(xiàn)象，也是單層傳代細胞的普遍現(xiàn)象。
軟骨細胞傳代方法
1. 低密度培養(yǎng)的軟骨細胞易發(fā)生去分化現(xiàn)象，一般最適接種密度為2~10×10^4/cm2;
2. 軟骨細胞代謝較為緩慢，無需增加換液頻度，可能破壞由細胞分泌而形成的群體化學環(huán)境。
傳代步驟
如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
