細胞生物學(xué)試劑 NEST 為您帶來更全面的細胞培養(yǎng)解決方案，在原有的高品質(zhì)細胞培養(yǎng)耗材產(chǎn)品線的基礎(chǔ)上，全面上線針對于培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、McCoy's 5A培養(yǎng)基、Leibovitz's L-15培養(yǎng)基）、活力檢測（細胞凋亡檢測試劑盒、細胞增殖檢測試劑盒）、細胞處理（抗生素/支原體清除劑、細胞消化解離試劑、細胞凍存試劑、平衡鹽溶液）三大方向所使用的試劑類產(chǎn)品，為高等院校、研究機構(gòu)、醫(yī)院、CRO 及 CDMO 企業(yè)提供更全面的服務(wù)。 在細胞培養(yǎng)過程中，時刻觀察細胞凋亡狀態(tài)及細胞增殖情況有利于實驗員做實驗整體規(guī)劃。本文將介紹NEST細胞生物學(xué)試劑。
細胞凋亡（Apoptosis）是細胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD）中特有的一種細胞死亡方式，在一系列內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生，旨在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
試劑盒檢測原理是什么？
NEST細胞凋亡檢測試劑盒采用細胞早期凋亡最常見的檢測方法——Annexin V-FITC/PI雙染法 (膜聯(lián)蛋白免疫檢測法)。
細胞發(fā)生凋亡時位于細胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)會翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面，暴露于細胞外環(huán)境中。
Annexin V是一種分子量為35.8KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠與凋亡的細胞膜表面的PS發(fā)生高親和力特異結(jié)合。
利用特異結(jié)合特性，NEST細胞凋亡檢測試劑盒采用雙熒光染色法，以熒光素(如FITC、PE)標記的Annexin V作為熒光探針，核酸染料碘化丙啶(Propidium lodide,PI)作為第二個標記，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可以區(qū)分早期、晚期凋亡細胞以及死細胞。
優(yōu)勢
? 檢測早期凋亡最理想的方法之一，不需固定環(huán)節(jié)從而避免假陽性的產(chǎn)生。
? 只需15-20分鐘，簡便快捷。
? 嚴格可靠的質(zhì)量控制，保證優(yōu)異的實驗結(jié)果
試劑盒操作步驟
1.樣品染色
1)將Binding Buffer(10×)稀釋成1×Binding buffer工作液備用(1mL Binding Buffer(10×) 需加入9mL無菌去離子水)。
2)收集細胞，加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細胞，共洗滌兩次。
3)在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細胞，使細胞濃度達到1×10^6 個/mL。
4)吸取100μL細胞懸液(細胞總數(shù)為1×10^5個)至一新管中，加入5μL Annexin V-FITC 和5-10μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。
2. 樣品檢測
1)流式細胞儀檢測：
染色孵育后，每管加入400μL1×Binding Buffer工作液， 混勻后使用流式細胞儀檢測。
2)熒光顯微鏡檢測：
染色孵育后涂片，顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被 Annexin V-FITC 結(jié)合的細胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細胞膜完整性的細胞細胞核顯示紅色，膜上有綠色光環(huán)。
注意事項
1)凋亡檢測實驗中細胞收集及處理是最重要的一環(huán)，對于懸浮細胞，可采用500-1000g，離心5min收集細胞。
對于貼壁細胞，用不含EDTA的胰酶進行消化（注：對于比較難消化的細胞，也可以用含低濃度EDTA的胰酶消化，最后細胞多洗幾遍，減小EDTA鰲合鈣離子產(chǎn)生的影響），500-1000g離心5min收集細胞。貼壁細胞消化時間過長會造成細胞膜的損傷，導(dǎo)致Annexin V結(jié)果假陽性。最好是在輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時終止消化。
2)Annexin V-FITC 和碘化丙啶(PI)是光敏物質(zhì)，在保存與操作時需避光。
3)可立式離心管內(nèi)試劑在開蓋前需短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
4)PI具有細胞毒性，染色時間不宜過長。為獲得準確試驗結(jié)果，建議樣品在染色后1小時內(nèi)進行分析。
5)在細胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免 PBS 殘留影響實驗結(jié)果。
試劑盒訂購信息
細胞增殖是指細胞在周期調(diào)控的因子下，通過DNA復(fù)制等反應(yīng)，完成細胞分裂的過程。增殖檢測一般是分析分裂中的細胞數(shù)量的變化，進而反應(yīng)細胞的生長狀態(tài)及活性。
試劑盒檢測原理是什么？
NEST細胞凋亡檢測試劑盒采用CCK-8法。
NEST細胞凋亡檢測試劑盒內(nèi)含有WST-8，是一種類似于MTT的化合物。在存在電子耦合試劑的情況下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶間接還原生成高度水溶性的橙黃色甲膜產(chǎn)物(formazan)。Formazan數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。
可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，可以間接反映活細胞的數(shù)量。
CCK-8法與傳統(tǒng)的測試方法相比，具有靈敏性高、反應(yīng)時間短、線性范圍寬，數(shù)據(jù)可靠、重現(xiàn)性好等特點。
試劑盒操作步驟
1)制備細胞懸液：細胞計數(shù)。
2)接種到96孔板中：按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個重復(fù)孔，每孔100μL細胞懸液。
3)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)24小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
根據(jù)實驗的實際需求進行后續(xù)不同操作
1.制作標準曲線(測定細胞具體數(shù)量時)
每孔加入10μLCCK-8增強型溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時間后測定450nm吸光度。
根據(jù)吸光度制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(X軸)， 吸光度為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量。
2.細胞活性檢測
每孔加入10μLCCK-8增強型溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時后在酶標儀下測定450nm吸光度。
3.細胞增殖-毒性檢測
在每孔加入0-10μL不同濃度的待測藥物后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)待測藥物的性質(zhì)和細胞的敏感性來設(shè)計細胞培養(yǎng)時間， 一般要根據(jù)細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。
如果待測藥物有氧化性或還原性的話，除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，加入新的培養(yǎng)基后在每孔加入10μL CCK-8增強型溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時后在酶標儀下測定450nm吸光度，從而去除藥物影響。
藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
吸光度建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600- 650nm。
4.計算公式
細胞存活率 = [(As - Ab)／(Ac - Ab)] ×100%
抑制率 = [(Ac - As)／(Ac - Ab)] ×100%
As ：實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測藥物)的吸光度
Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測藥物)的吸光度
Ab ：空白孔(不含細胞和待測藥物的培養(yǎng)基、 CCK-8)的吸光度
注意事項
1)由于每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
2)因細胞種類不同，加入CCK-8增強型溶液后孵育形成的Formazan的量也不一樣，需要根據(jù)顯色情況調(diào)整孵育時長。對于大多數(shù)情況孵育1小時即可。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間，如5-6 小時。
3)如果暫時不測定吸光度，為避免吸光度變化，可以向每孔中加入10μL0.1M HCl溶液或1%w/vSDS溶液，遮蓋培養(yǎng)板室溫下避光保存。最多維持24小時。
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